Dynamique des cellules immunitaires déconvoluée par un seul

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2285 (2023) Citer cet article

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La machine de perfusion normothermique (NMP) s'est imposée comme une technique innovante de préservation des organes. Il est essentiel de développer une compréhension de la composition des cellules immunitaires de l'organe donneur et de ses changements dynamiques au cours de la NMP. Nous avons visé une caractérisation complète des (sous)populations de cellules immunitaires, du trafic cellulaire et de la libération de cytokines au cours de la NMP hépatique. Le profilage du transcriptome unicellulaire des foies de donneurs humains avant, pendant la NMP et après la transplantation montre une abondance de neutrophiles du récepteur de chimiokine CXC 1+/2+ (CXCR1+/CXCR2+), qui a considérablement diminué pendant la NMP. Cela s'accompagne d'un efflux important de leucocytes passagers avec une prédominance de neutrophiles dans le perfusat. Au cours de la NMP, les neutrophiles passent d'un état pro-inflammatoire à un phénotype vieilli/activé/épuisé de manière chronique, tandis que les monocytes/macrophages anti-inflammatoires/tolérogènes sont augmentés. Nous décrivons ici la dynamique du répertoire des cellules immunitaires, les déplacements des cellules immunitaires phénotypiques et une dominance des neutrophiles au cours de la NMP du foie, qui contribuent potentiellement à la réponse inflammatoire. Nos résultats peuvent servir de ressource pour lancer de futures études immuno-interventionnelles.

La transplantation hépatique (LT) est le seul traitement définitif de la maladie hépatique en phase terminale1,2,3. La pénurie d'organes reste un facteur limitant majeur, la demande dépassant de loin l'offre. Le besoin de meilleures technologies de conservation en conjonction avec des taux d'utilisation plus élevés dans les organes de donneurs à critères étendus (ECD) a alimenté le développement de la perfusion de machine normothermique (NMP). Ainsi, un organe est perfusé en continu dans des conditions proches des conditions physiologiques à 37 ° C avec des concentrés d'érythrocytes oxygénés et héparinés complétés par de la nutrition et des antibiotiques et dans un système stérile fermé. La NMP permet une évaluation complète de la qualité et de la fonction des organes pendant la conservation ex vivo et peut servir de plate-forme pour le reconditionnement, le traitement et la réparation des organes extracorporels2,4,5,6,7,8,9.

Plusieurs centaines d'organes ont été perfusés par machine avec succès et les résultats à court terme indiquent que la NMP pourrait aider à réduire les taux de rejet d'organes et servir une sélection appropriée d'organes adaptés à la transplantation4,10,11,12. Cependant, alors que la fonction organique grossière est facilement mesurable, on sait peu de choses sur l'état immunitaire d'un organe et de ses leuccyotes résidant dans les tissus pendant la NMP. Dans des études expérimentales de perfusion pulmonaire et rénale ex vivo, un grand nombre de leucocytes passagers sont mobilisés et s'extravasent dans le perfusat, affectant ainsi l'immunogénicité du greffon13,14. Des données suggérant la mobilisation des leucocytes passagers dans le perfusat ont également été publiées dans le foie NMP15. Compte tenu de la capacité inflammatoire et de l'ampleur des cellules immunitaires intrinsèques au foie, une compréhension plus approfondie de l'impact de la NMP sur l'état des cellules immunitaires hépatiques et de sa dynamique au cours de la NMP est d'une importance cruciale. Ici, la cartographie détaillée des leucocytes passagers à l'aide de la technologie de séquençage d'ARN unicellulaire du transcriptome entier (scRNASeq)16 a été considérée comme améliorant considérablement notre compréhension des mécanismes moléculaires, y compris les circuits inflammatoires pendant la NMP hépatique. Ces dernières années, les études scRNASeq visaient à évaluer l'hétérogénéité cellulaire des foies humains dans diverses conditions, y compris les lésions d'ischémie/reperfusion (IRI)17,18,19,20,21,22,23,24. Une cartographie approfondie des cellules immunitaires en série de huit foies de donneurs humains avant et à la fin de la NMP a été appliquée pour étudier spécifiquement la source des cytokines/chimiokines immunomodulatrices et la dynamique de l'activation immunitaire au niveau de la cellule unique. Nous avons validé et visualisé nos résultats par coloration immunofluorescente multiplex (IF) dans des biopsies hépatiques. La mobilisation correspondante des cellules immunitaires a été caractérisée par le phénotypage dans des échantillons de perfusat en série collectés au cours de 26 NMP de foie humain, ainsi que par le profilage et la quantification des cytokines.

Dans ce travail, la cartographie des cellules immunitaires profondes montre la prédominance des neutrophiles dans les foies de donneurs humains, qui sont mobilisés dans le perfusat au début de la NMP hépatique. L'évaluation du phénotype et de la dynamique du répertoire des cellules immunitaires hépatiques ainsi que les modèles de communication cellule à cellule correspondants améliorent notre compréhension de l'immunologie des foies normothermiquement perfusés par machine.

Un aperçu de la population globale de l'étude est présenté dans le tableau 1 (les données individuelles sont présentées dans le tableau supplémentaire 1). Des informations détaillées sur les foies d'étude et l'analyse sont fournies sous forme de schéma de flux de travail à la Fig. 1. La décision d'appliquer la NMP était basée sur une ou une combinaison des indications suivantes : (D) qualité d'organe présumée faible, (R) receveur chirurgicalement complexe et/ou (L) logistique (fichier de données source). La durée du PNM dépendait du temps requis pour l'évaluation et du temps ciblé pour la chirurgie2,4,25. Le temps NMP médian était de 19,13 h (h) (intervalle interquartile (IQR) 11,56–21,64). Le pic médian de l'aspartate transaminase (AST) et de l'alanine transaminase (ALT) était de 6410 U/l (IQR 2422–13 696) et 3194 U/l (IQR 1402–7791), le niveau médian de lactate à 6 h était de 12 mmol/l (IQR 18–180). La décision de transplanter ou de jeter un foie était basée sur des paramètres de perfusion tels que définis précédemment2,4,25. Selon des critères prédéfinis (voir méthodes), 24 foies ont été transplantés après NMP, tandis que dix ont été refusés en raison de l'incapacité à maintenir des valeurs de pH physiologiques, d'une dégradation inadéquate du lactate et de niveaux élevés de perfusat d'AST/ALT.

Alors qu'un total de 34 foies de donneurs ont été inclus dans cette étude et soumis à la NMP, huit des 34 foies de donneurs ont été sélectionnés au hasard pour le scRNASeq et 26 sur 34 pour l'échantillonnage du perfusat. De plus, des échantillons de tissus ont été prélevés dans les 34 foies pour évaluer et valider les résultats au niveau des protéines. Des informations sont fournies sur les points de temps d'échantillonnage, l'analyse, le donneur ainsi que le statut de transplantation des organes. FFPE frais congelé inclus en paraffine, perfusion machine normothermique NMP, reperfusion RP, immunofluorescence IF, immunohistochimie IHC, donneur DBD après mort cérébrale, donneur DCD après mort circulatoire.

Le modèle de receveur médian pour l'insuffisance hépatique en phase terminale (MELD) et le score de balance des risques (BAR) étaient de 14 (IQR 11–18) et 7 (IQR 7–10). L'âge médian des bénéficiaires était de 60 ans (IQR 55–68). Le séjour médian en unité de soins intensifs (USI) et le séjour total à l'hôpital étaient de 5 (IQR 3–9) et 21 jours (IQR 15–30). Neuf patients (37 %) ont développé un dysfonctionnement précoce de l'allogreffe (DAE). Des complications de grade Clavien-Dindo> 3 sont survenues chez 11 (46%) patients. Trois patients sont décédés d'une septicémie fongique, un d'une septicémie à Clostridium difficile et un des suites d'une cholangiosepsie. La survie du greffon après décès était de 100 % (Tableau 2).

Dans un premier temps, le répertoire global des cellules immunitaires de huit foies de donneurs soumis à la NMP a été caractérisé avant la NMP (T0), à la fin de la NMP (T1) et après la reperfusion (T2) à l'aide du profilage scRNASeq (Fig. 2A). Nous avons annoté les populations de cellules les plus pertinentes à l'aide d'un regroupement non supervisé (Fig. 2B). Nos analyses décrivent la composition cellulaire et la dynamique de l'expression génique de tous les types de cellules hépatiques composant le parenchyme, y compris les cellules inflammatoires du foie. Alors que l'ensemble des données est mis à disposition et que le phénotype d'expression génique et la dynamique des cellules constituantes sont intéressants et pertinents, cette étude s'est concentrée sur les changements dynamiques des cellules inflammatoires hépatiques lors de la perfusion ex vivo de foies de donneurs humains.

Un aperçu du flux de travail scRNASeq. Les proportions de cellules épithéliales (KRT18), de leucocytes (PTPRC/CD45) et de cellules endothéliales (SPARC) dans l'ensemble de données scRNASeq obtenu sont indiquées. B Tracé d'approximation et de projection uniformes de variété (UMAP) de 118 448 cellules individuelles, codées par couleur par type de cellule. C Composition relative des types de cellules dans les tissus hépatiques de huit patients individuels. Parcelles D UMAP, codées par couleur pour l'expression des gènes marqueurs spécifiques au type de cellule indiqués (pointes de flèches rouges). E Niveaux d'expression génique de marqueurs spécifiques de type cellulaire. F La proportion de populations de leucocytes dans le tissu hépatique telle que déterminée par scRNASeq vs cytométrie en flux. Graphique UMAP coloré par le nombre de transcrits par cellule. L'échelle de couleurs est écrêtée à 20 000. H Boxplot du nombre de transcrits par type de cellule. Les valeurs indiquent la moyenne par patient (n = 8). La ligne centrale indique la médiane. Les cases représentent l'intervalle interquartile (IQR) des données, les moustaches s'étendent jusqu'aux points de données les plus extrêmes à moins de 1,5 fois l'IQR.

Les gènes marqueurs ont été analysés pour annoter des types cellulaires spécifiques, tels que les neutrophiles (FCGR3B), les monocytes/macrophages (CD68), les lymphocytes T CD3+ (CD3E), les lymphocytes T CD4+ (CD4), les lymphocytes T CD8+ (CD8A), les lymphocytes T régulateurs (Tregs) (FOXP3), les cellules tueuses naturelles (NK) (NKG7), les cellules dendritiques (FLT3), les cellules progénitrices (CD24), les cellules B (CD79A), plasmocytes (JCHAIN), hépatocytes (ALB), cellules endothéliales (FLT1) et cholangiocytes (KRT19 ; Fig. 2D, E, Fig. 2 supplémentaire). Pour assurer une interprétation robuste des données, nous nous sommes concentrés sur les signatures de gènes marqueurs pour définir des types cellulaires distinctifs, ce qui a corroboré la validité de notre processus d'annotation (fichier de données source).

Bien qu'une certaine hétérogénéité inter-patients ait été observée, la composition cellulaire globale était comparable entre les organes (Fig. 2C, Supplémentaires Fig. 3A, B). Les neutrophiles ont été identifiés comme le principal groupe de cellules immunitaires chez tous les patients (48,7 % ; 57 564 cellules) et la lignée monocyte/macrophage comme le deuxième type de cellules immunitaires dominant dans le foie (7,75 % ; 18 682 cellules ; Fig. 2C ; les patients individuels voir le fichier de données source). De manière concordante, l'immunohistochimie (IHC) a montré que les neutrophiles (CD15) et les monocytes / macrophages (CD68) étaient des populations de leucocytes résidentes dominantes dans le tissu hépatique (Fig. 4 supplémentaire). La proportion de leucocytes identifiés par scRNASeq a été validée par cytométrie en flux dans les échantillons correspondants (Fig. 2F).

Les neutrophiles ont été définis par une teneur en ARNm exceptionnellement faible et donc par un nombre relativement faible de transcrits détectés par cellule (Fig. 2G, H; des mesures QC supplémentaires sont présentées dans la Fig. 3D, E supplémentaire). Nous avons récemment démontré que, par rapport à d'autres plates-formes scRNASeq, le flux de travail BD Rhapsody capture un nombre particulièrement élevé de molécules d'ARNm par cellule et peut donc être particulièrement bien adapté pour représenter les cellules à faible teneur en ARNm26. Par conséquent, en raison du nombre relativement élevé de molécules d'ARNm capturées par cellule, des neutrophiles avec une teneur en ARNm relativement faible ont été identifiés dans notre ensemble de données scRNASeq (Fig. 2H ; nCount_RNA moyen : 4106 ; nCount_RNA moyen dans les neutrophiles : 2050) mais pas dans les ensembles de données précédemment publiés.

En résumé, l'atlas des cellules immunitaires est basé sur un total de 21 échantillons de biopsie prélevés sur huit foies de donneurs humains avant, à la fin de la PNM ainsi qu'après la reperfusion. Nos analyses déconvoluent la composition cellulaire et dépeignent des neutrophiles précédemment non reconnus à une résolution unicellulaire.

Afin d'étudier l'impact de la NMP sur le paysage des cellules immunitaires du foie, nous avons évalué les différences dans les profils scRNASeq d'échantillons de biopsie en série prélevés avant la NMP (T0) et à la fin de la NMP (T1) (Fig. 3A ; les nombres de cellules de chaque type de cellule à T0 et T1 sont indiqués dans le fichier Source Data).

Une parcelle UMAP de 90 404 cellules individuelles (uniquement les échantillons T0 et T1), codées par couleur par type de cellule. B Composition relative des types de cellules dans les tissus hépatiques avant (T0) et à la fin de (T1) NMP. C Parcelle UMAP de 90 404 cellules individuelles, codées par couleur par point temporel [avant (T0) et à la fin de (T1) NMP]. Les groupes de monocytes/macrophages (1) et de neutrophiles (2) sont mis en évidence. D Images d'immunofluorescence multiplex de marqueurs immunologiques présentés seuls et avec la pan-cytokératine et la carte de phénotypage pré (T0) et à la fin de (T1) NMP. La carte de phénotypage a été générée dans InForm, chaque point de couleur représente un phénotype de la cellule, points noirs : autres cellules de phénotype inconnu. Les images sont affichées à un grossissement ×20 (barre d'échelle : 100 µm). E, F Densités cellulaires (nombre de cellules/mm2) pour les marqueurs immunologiques individuels chez 10 patients. Le panneau supérieur E présente les valeurs pour chaque foie individuel pré (T0) et à la fin de (T1) NMP. Le panneau inférieur F présente une analyse statistique de colonne pour chaque biomarqueur (n = 10, test t apparié, bilatéral, moyenne ± SEM, ** p = 0,0097).

Plus frappant encore, la proportion de neutrophiles a diminué avec le temps de perfusion, alors que la proportion de monocytes/macrophages, de lymphocytes T et de lymphocytes B n'a changé que de manière marginale au cours de la NMP (Fig. 3B). L'utilisation de la coloration IF multiplex de diverses cellules immunitaires dans des biopsies prélevées sur 10 foies supplémentaires a confirmé ces résultats : la NMP n'a pas affecté de manière significative le nombre et la distribution des monocytes/macrophages (CD68), des lymphocytes T (CD3 et CD8) et des lymphocytes B (CD20), tandis que le nombre absolu de neutrophiles (CD15) a diminué de manière significative (p < 0,001) au fil du temps (Fig. 3D – F), bien que les neutrophiles restent proéminents tout au long de la période de perfusion (Fig. 3B, D–F).

Fait intéressant, la NMP a induit un changement notable dans le profil transcriptomique des neutrophiles et des monocytes / macrophages (Fig. 3C), tandis que le niveau de stress cellulaire défini par la quantité relative de transcrits mitochondriaux détectés (% MT, Fig. 5A supplémentaire) et les niveaux d'expression génique d'un ensemble de transcrits importants liés au stress et à l'apoptose (Fig. 5B supplémentaire) n'ont pas été nettement affectés par la NMP. En résumé, la NMP diminue de manière significative la quantité et la proportion des neutrophiles hépatiques au cours du temps de perfusion, tandis que les autres principaux types de cellules immunitaires ne sont pas nettement affectés.

Nous avons ensuite évalué la signature transcriptomique des neutrophiles comprenant la plus grande population de cellules immunitaires intrahépatiques et annoté des sous-populations pour étudier plus en détail l'impact de la NMP sur l'expression des gènes et les changements de phénotype. La figure 4A représente des gènes marqueurs connus dans les neutrophiles, notamment IFITM2, CSF3R, FPR1, FCGR3B, VNN2, G0S2, CXCR2 et SOD2. CXCR2 présente un intérêt particulier, car il est principalement exprimé dans le groupe de neutrophiles (Fig. 4B, C; les données individuelles des patients et des biopsies sont présentées dans la Fig. 6A supplémentaire). Nous avons observé un schéma d'expression comparable pour CXCR1 (Fig. 4C, Fig. 6B supplémentaire). Par conséquent, la NMP a entraîné une réduction significative des niveaux d'expression des gènes CXCR2 et CXCR1 (Fig. 4D). Nous avons validé l'expression de la protéine correspondante du récepteur de chimiokine CXC (CXCR) 2 sur les neutrophiles par coloration multiplex IF de 10 foies avant et à la fin de la NMP (Fig. 4E). Semblable à la diminution du nombre de neutrophiles (Fig. 3D – F), l'expression de la protéine CXCR2 sur les neutrophiles a été considérablement réduite au cours de la NMP (Fig. 4F). Parallèlement, l'expression de l'ARNm de CXCR4 était nettement élevée pendant la NMP, indiquant une augmentation potentielle de la proportion de neutrophiles épuisés/âgés (Fig. 4D)27.

A Niveaux d'expression génique des gènes spécifiques des neutrophiles dans les types de cellules individuelles. B Niveaux d'expression du gène CXCR2 dans les types de cellules individuelles. Chaque point représente la moyenne d'un patient (n = 8). C Parcelles UMAP de 41 177 neutrophiles, codées par couleur par point temporel et niveaux d'expression des gènes CXCR2, CXCR1 et CXCR4. D Niveaux d'expression des gènes CXCR2, CXCR1 et CXCR4 dans les neutrophiles avant (T0) et à la fin de (T1) NMP. Chaque point représente la moyenne d'un patient (n = 7). Les taux de fausses découvertes (FDR) ont été déterminés à l'aide d'une analyse pseudo-bulk avec DESeq2. E Coloration immunofluorescente de CXCR2 et CD15 pré (T0) NMP. Les images sont affichées à un grossissement ×20 (barre d'échelle : 100 µm, n = 10, pour chaque échantillon 4 images représentatives ont été prises). F Densité cellulaire (nombre de cellules/mm2) des cellules CXCR2+ avant (T0) et à la fin de (T1) NMP. Le graphique supérieur présente les valeurs pour chaque foie individuel, le graphique inférieur est une analyse statistique de colonne (n = 10, test t apparié, bilatéral, moyenne ± SEM, * p = 0,02). Niveau d'expression du gène G CXCL8 dans les neutrophiles pré (T0) et à la fin de (T1) NMP. Chaque point représente la moyenne d'un patient (n = 7). Les taux de fausses découvertes (FDR) ont été déterminés à l'aide d'une analyse pseudo-bulk avec DESeq2. Parcelle H UMAP de 90 404 cellules individuelles (uniquement les échantillons T0 et T1), colorées par l'expression du gène CXCL8. Les clusters monocyts/macrophages (1) et neutrophiles (2) sont mis en évidence. I Signalisation différentielle des neutrophiles aux autres types de cellules. Panneau supérieur : ligands de neutrophiles exprimés de manière différentielle en T0 par rapport à T1 (test de Wald DESeq2 bilatéral sur pseudo-volume, les valeurs de p ont été ajustées au taux de fausse découverte (FDR)). Les couleurs rouges indiquent une régulation à la hausse en T1 par rapport à T0. Panneau inférieur : récepteurs respectifs et expression par type de cellule. La taille et la couleur des points font référence à la fraction de cellules exprimant respectivement l'expression du récepteur et du gène, en moyenne sur tous les patients. Les points ne sont affichés que pour les récepteurs qui sont exprimés dans au moins 10 % des types de cellules respectifs. Dans toutes les boîtes à moustaches, la ligne centrale indique la médiane. Les cases représentent l'intervalle interquartile (IQR) des données, les moustaches s'étendent jusqu'aux points de données les plus extrêmes à moins de 1,5 fois l'IQR.

L'impact de la NMP sur la signature génique des neutrophiles a été évalué plus en détail par une analyse des gènes exprimés de manière différentielle (DEG) (T0 contre T1; les DEG régulés et sélectionnés en haut sont présentés dans la Fig. 6C supplémentaire). Nous avons identifié une régulation à la hausse significative de CXCL8 / IL-8 dans le groupe de neutrophiles pendant la NMP (Fig. 4G; Fichier de données source). CXCL8 est un ligand pro-inflammatoire apparenté pour CXCR2 et CXCR1 et qui médie l'activation des neutrophiles et la formation de pièges extracellulaires de neutrophiles (NET)28. Les neutrophiles et, dans une moindre mesure, les monocytes / macrophages étaient les principales sources de production de CXCL8 (Fig. 4H). De même, l'analyse des réseaux de communication de cellule à cellule à l'aide de CellChat29 a indiqué l'activation des neutrophiles autocrines (Fig. 4I) ainsi que l'activation des neutrophiles déclenchée par les monocytes/macrophages (voir ci-dessous) via la signalisation CXCL8-CXCR1/CXCR2 pendant la NMP, respectivement.

Le profil transcriptionnel des neutrophiles à la fin de la NMP ressemblait à un phénotype que nous avons récemment identifié et caractérisé comme des neutrophiles âgés/activés de manière chronique/épuisés dans les tissus tumoraux du cancer du poumon non à petites cellules (Fig. 5A : expression réduite de CXCR1, CXCR2, PTGS2, SELL et expression élevée de CXCR4, CD83, CCRL2, CCL3, CCL4, ICAM1)26. La régulation à la hausse du VEGFA (Fig. 5A, Fig. 6C supplémentaire) ainsi que les schémas de communication cellulaire VEGFA-KDR1 / FLT1 élevés des neutrophiles vers les cellules endothéliales (Fig. 4I), suggèrent que la réparation tissulaire NMP est induite via la revascularisation du tissu endommagé.

A Expression de gènes marqueurs sélectionnés dans les neutrophiles pré (T0) et à la fin de (T1) NMP chez des patients individuels (n = 7). La ligne centrale indique la médiane. Les cases représentent l'intervalle interquartile (IQR) des données, les moustaches s'étendent jusqu'aux points de données les plus extrêmes à moins de 1,5 fois l'IQR. Test de Wald DESeq2 bilatéral sur pseudo-bulk, les valeurs de p sont ajustées au taux de fausses découvertes (FDR) à l'aide d'une pondération d'hypothèse indépendante (IHW). B UMAP de neutrophiles colorés par sous-clusters (N0, N1, N2, N3). C Expression de gènes marqueurs sélectionnés dans des sous-groupes de neutrophiles. D Composition relative des sous-groupes de neutrophiles avant (T0) et à la fin de (T1) NMP. E Activité différentielle du facteur de transcription (TF) par type de cellule en T0 par rapport à T1 calculée à l'aide de DoRothEA. Le rouge indique une régulation à la hausse d'un régulon TF en T1 par rapport à T0. Les valeurs de p ont été déterminées à l'aide d'un test t bilatéral et ajustées en fonction du taux de fausses découvertes (FDR). Les statistiques t ont été calculées à l'aide d'un modèle linéaire multivarié tel qu'implémenté dans decoupler-py. F Analyse de la surreprésentation de l'ensemble de gènes (ORA) des ensembles de gènes "Hallmark" sélectionnés par type de cellule en T0 par rapport à T1. Une petite valeur p indique que parmi les gènes de l'ensemble de gènes, plus de gènes sont exprimés de manière différentielle que prévu par hasard (test exact de Fisher unilatéral).

Ensuite, nous avons séparé les neutrophiles par regroupement de Leiden non supervisé en quatre sous-ensembles (N0 – N3; Fig. 5B; les gènes les plus régulés sont indiqués dans le fichier de données source), qui a été soutenu par tous les patients (Données supplémentaires 6D). Le cluster N0 était caractérisé par l'expression de gènes pro-inflammatoires induisant la migration des neutrophiles vers les sites d'inflammation (S100A12, S100A8, S100A9, MMP8, MMP9)30,31,32, le cofacteur NETosis PADI433, ainsi que des gènes impliqués dans l'adhésion cellulaire médiée par les intégrines (ITGAM, ITGA1, ITGA6). Par conséquent, le cluster N0 représente un phénotype de neutrophile pro-inflammatoire hautement activé. Le cluster N1 était assez similaire au cluster N0 mais présentait une expression élevée de ITGA4 ainsi que de TAFA4 qui module les fonctions de réparation des tissus macrophages34 (Fig. 5C, fichier Source Data). Notamment, la proportion de neutrophiles pro-inflammatoires N0 et N1 a clairement diminué au cours de la NMP, alors que les neutrophiles N2 ont été nettement enrichis (Fig. 5D). Le cluster N2 ressemblait au phénotype vieilli/activé chroniquement/épuisé décrit ci-dessus (CXCR4, CD83, CCRL2, CCL3, CCL4, ICAM1, VEGFA). Les neutrophiles N2 exprimaient également OLR1 (Fig. 5C, fichier Source Data), un marqueur que nous avons récemment identifié dans les neutrophiles associés aux tumeurs activés de manière chronique26. De manière concordante, l'analyse de l'activité du facteur de transcription (TF) a révélé que la NMP déclenchait une induction significative de PPARG (Fig. 5E), un régulateur transcriptionnel direct d'OLR135. Le cluster N3 a montré une expression élevée de gènes mitochondriaux (MT-CYB, MT-ND4, MT-ATP6), indiquant le début de l'apoptose cellulaire, ainsi que des gènes impliqués dans la réponse de phase aiguë (SAA1, SAA2) et la signalisation de l'interféron (IFIT1, IFIT2)36 (Fig. 5C, fichier Source Data). Notamment, les neutrophiles N3 ont diminué pendant la NMP (Fig. 5D).

Pris ensemble, nos résultats indiquent que la NMP déplace les neutrophiles d'un état pro-inflammatoire activé vers un phénotype vieilli/activé/épuisé de manière chronique dans le foie humain, suggérant une atténuation des processus inflammatoires aigus déclenchés par les neutrophiles pendant la NMP.

Afin d'évaluer les associations entre les profils d'expression de populations cellulaires distinctes et des ensembles de gènes sélectionnés indicatifs de processus et de voies cellulaires, des analyses d'enrichissement d'ensembles de gènes (GSEA) ont été effectuées (Fig. 5F). Plusieurs voies impliquées dans les réponses inflammatoires, l'apoptose et les activités suppressives de tumeurs ont été reconnues dans les neutrophiles. Les monocytes/macrophages signalaient les voies impliquées dans les fonctions effectrices du complément. L'activation du complément est impliquée dans les processus inflammatoires chroniques, mais soutient également un microenvironnement immunosuppresseur et induit l'angiogenèse ainsi que la réparation tissulaire37. Ces résultats suggèrent une évolution vers les monocytes/macrophages aux propriétés anti-inflammatoires, de cicatrisation tissulaire et de régénération.

Étant donné que les monocytes/macrophages ont une fonction régulatrice clé dans les réponses inflammatoires hépatiques, nous avons évalué leur phénotype plus en détail. Les monocytes / macrophages caractérisés par l'expression du marqueur de surface cellulaire CD68 ont été considérablement modifiés dans leur profil transcriptomique au cours de la NMP (Fig. 3C, 6A, Fig. 7A supplémentaire; Fig. 6B: gènes marqueurs connus dans les cellules monocytes / macrophages CST3, CTSB, MS4A7, MARCH1, CD68, MAFB, CD163, VCAN et CSF1R) 38,39. L'expression élevée de CXCL8 dans les monocytes/macrophages (Fig. 4H) et l'induction significative de chimiokines pro-inflammatoires CCL2 et CCL3 (le DEG supérieur sélectionné dans les cellules monocytes/macrophages avant et à la fin de la NMP sont illustrés dans la Fig. 7C supplémentaire) indiquent que pendant la NMP, le phénotype des monocytes/macrophages se déplace vers un état pro-inflammatoire. L'analyse de la communication cellule-cellule a indiqué une signalisation SPP1 (ostéopontine) fortement élevée vers ses récepteurs apparentés (par exemple CD44) exprimés sur une variété de cellules immunitaires (Fig. 6G). L'ostéopontine affecte l'inflammation aiguë et chronique car elle régule la migration, la polarisation et l'activation des cellules immunitaires40. Contrairement à la stimulation pro-inflammatoire, la NMP diminue l'expression de gènes clés caractérisant l'état inflammatoire des monocyes/macrophages (LYZ, FCN1, VCAN, HLA-DRA, S100A8, S100A9, S100A12, MNDA, CSTA, CD74) et élève le niveau d'expression de marqueurs associés à un phénotype tolérogène (CD163, MARCO, HMOX1, VSIG4, NSMA F, CTSB, VMO1 ; Fig. 6B et Fig. Supplémentaire 7C)17. Traditionnellement, les macrophages sont classés comme inflammatoires ou immunorégulateurs41. L'expression du gène VSIG4 médie la tolérance des cellules T et tueuses naturelles (NKT) lors d'une lésion hépatique à médiation immunitaire42. De même, l'inactivation de HMOX1 (hémoxygénase) chez la souris entraîne une inflammation hépatique43. Mac Parland et al. ont démontré que l'expression de MARCO est principalement élevée dans les macrophages humains non inflammatoires17.

A UMAP-plots de 13 720 monocytes/macrophages, codés par couleur par moment [avant (T0) et à la fin de (T1) NMP], et du niveau d'expression relatif du gène CD68. B Niveaux d'expression génique des marqueurs inflammatoires (LYZ, FCN1, VCAN, HLA-DRA) et des marqueurs tolérogènes (CD163, MARCO, HMOX1 et VSIG4) dans les monocytes/macrophages avant (T0) et à la fin de la NMP (T1). Chaque point représente la moyenne d'un patient (n = 7). Les taux de fausses découvertes (FDR) ont été déterminés à l'aide d'une analyse pseudo-bulk avec DESeq2. La ligne centrale indique la médiane. Les cases représentent l'intervalle interquartile (IQR) des données, les moustaches s'étendent jusqu'aux points de données les plus extrêmes à moins de 1,5 fois l'IQR. C Niveaux d'expression génique des gènes spécifiques aux monocytes/macrophages. D UMAP de monocytes/macrophages colorés par sous-clusters (M0, M1, M2, M3). E Expression de gènes marqueurs sélectionnés dans des sous-groupes de monocytes/macrophages. F Composition relative des sous-groupes de monocytes/macrophages avant (T0) et à la fin de (T1) NMP. G Signalisation différentielle des monocytes/macrophages vers d'autres types de cellules. Panneau supérieur : ligands différentiellement exprimés de monocytes/macrophages en T0 par rapport à T1 (test de Wald DESeq2 bilatéral sur pseudo-volume, les valeurs de p ont été ajustées au taux de fausse découverte (FDR)). Les couleurs rouges indiquent une régulation à la hausse en T1 par rapport à T0. Panneau inférieur : récepteurs respectifs et expression par type de cellule. La taille et la couleur des points font référence à la fraction de cellules exprimant respectivement l'expression du récepteur et du gène, en moyenne sur tous les patients. Les points ne sont affichés que pour les récepteurs qui sont exprimés dans au moins 10 % des types de cellules respectifs. Seuls les ligands régulés positivement sont représentés. La liste des interactions sous-régulées est disponible dans le fichier Source Data.

Pour disséquer davantage la plasticité des monocytes / macrophages pendant la NMP, nous avons effectué un regroupement de Leiden non supervisé et identifié quatre sous-ensembles distincts (M0 à M3) (Fig. 6D, Fig. 6E; les gènes marqueurs les plus régulés sont indiqués dans le fichier Source Data) dans tous les foies (Fig. 7D supplémentaire). Le sous-cluster M0 a montré une expression élevée de plusieurs gènes pro-inflammatoires, suggérant que ce cluster représente des monocytes/macrophages inflammatoires (LYZ, VCAN, S100A8, S100A9, S100A12, MNDA). Conformément à l'analyse DEG, la proportion de monocytes/macrophages M0 pro-inflammatoires a été fortement réduite au cours de la NMP (Fig. 6F). Le sous-cluster M1 était étonnamment similaire à une population de macrophages C1Q+ fréquemment signalée (C1QB, MRC1, HLA-DOA, FOLR2)44. La régulation à la hausse observée des gènes liés à la voie du complément (C1QB, C1QC, AXL) suggère un rôle potentiel du sous-cluster M1 dans la clairance des tissus lésés via l'efférocytose45,46. Au contraire, le cluster M2 a montré un profil d'expression génique comparable aux monocytes non classiques (CDKN1C, CYFIP2)47,48, ainsi qu'une expression élevée de CX3CR1, un marqueur qui définit les monocytes se rapprochant constitutivement des tissus et contribue à la réparation tissulaire et à la cicatrisation49. Alors que les sous-clusters M1 et M2 n'ont pas été sensiblement modifiés pendant le NMP, le cluster M3 a été significativement augmenté (Fig. 6F). Ce sous-groupe était caractérisé par l'expression de marqueurs principalement associés à des macrophages activés alternativement ("M2-like"). Les macrophages de type M2 induisent la prolifération cellulaire et l'angiogenèse, mais sont également impliqués dans l'élimination des débris cellulaires et favorisent la réparation des tissus (PLAU, CXCL5, CFS1, FPR3, SPP1, CTSL, IL4I1, HS3ST1, SERPINB2, SLC7A11)50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61. Le sous-cluster M3 exprimait également FN1 (fibronectine), qui est impliquée dans la formation de la matrice extracellulaire et les mécanismes de réparation des plaies62. Il convient de noter que l'analyse de la communication cellule-2-cellule dans les monocytes/macrophages a indiqué une signalisation FN1 élevée, par exemple vers son récepteur apparenté ITGB1 exprimé sur les cholangiocytes (Fig. 6G). De plus, de nombreux marqueurs anti-inflammatoires ont été identifiés dans le cluster M3 : les marqueurs PHLDA1, MMP19, FABP5, NRP1, NRP2, RASGRP3, DHRS9, MT1H indiquent une atténuation potentielle de la production de cytokines pro-inflammatoires63,64,65,66,67,68,69,70,71.

En résumé, nos données ont montré que l'induction de fabricants pro-inflammatoires et d'un phénotype pro-inflammatoire global de monocytes/macrophages s'accompagne de l'induction de sous-types cellulaires anti-inflammatoires et tolérogènes ("M2-like") contribuant à la prolifération cellulaire, à l'angiogenèse, à la cicatrisation et à la réparation des tissus.

Après avoir défini le paysage unicellulaire des cellules immunitaires résidentes dans les tissus pendant la NMP, nous nous sommes ensuite concentrés sur le compartiment du perfusat. Par conséquent, nous avons étudié la dynamique des cellules immunitaires dans le perfusat de 26 foies supplémentaires et avons lié ces observations aux altérations intra-hépatiques des cellules immunitaires au cours de la NMP (Fig. 7A). La viabilité cellulaire a été confirmée dans une série d'échantillons de perfusat (Fig. 7B). Dès 1 h après l'initiation de la NMP, une augmentation rapide du nombre absolu de leucocytes CD45+ a été observée (2537/µl [2003, 3215]). Les sous-ensembles dominants étaient les granulocytes CD45+HLA-DRlow (1947/µl [1510, 2511]), les lymphocytes T CD45+CD3+ (203/µl [157, 263]), les cellules CD45+CD56+ NK (99/µl [68, 143]), les lymphocytes B CD45+CD19+ (52/µl [38, 71]), et monocytes/macrophages CD45+CD14+ (37/µl [26, 54]) (Fig. 7C, D). L'analyse de régression a indiqué un changement statistiquement significatif du nombre absolu de cellules au cours du temps de perfusion pour tous les sous-types de leucocytes. Alors que les lymphocytes B CD45 + CD19 + et les monocytes / macrophages CD45 + CD14 + ont culminé à 6 h, une diminution du nombre total de leucocytes a été observée pour tous les sous-ensembles au-delà de 6 h de NMP (Fig. 7E, F, Tableau supplémentaire 2).

Un flux de travail d'analyse de perfusat NMP et des méthodes appliquées. Les tests de viabilité des cellules B avant la cytométrie en flux (n = 3 avant, à 1 h de NMP et à la fin de la NMP) n'ont montré qu'un très faible pourcentage de cellules non viables dans le perfusat. C Quantités absolues de leucocytes CD45+ pour les principaux sous-types de cellules immunitaires dans le perfusat circulant total (moyenne ± SEM) et composition D à 1 h de NMP. E, F Changement dynamique des leucocytes CD45+ totaux et des principaux sous-types au cours de la NMP. G Changement dynamique des sous-types de lymphocytes T CD3+ (proportions) au cours du temps de perfusion. Les graphiques montrent les effets marginaux. Les valeurs sont estimées à l'aide d'une analyse de régression linéaire. Les valeurs de p font référence au changement dans le temps. Les moyennes des moindres carrés calculées à l'aide d'un modèle linéaire sont présentées avec l'IC à 95 %. N = 26 échantillons biologiquement indépendants. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Cellules NK cellules tueuses naturelles, cellules NKT cellules tueuses naturelles, cellules MAIT cellules T invariantes associées à la muqueuse.

La proportion de neutrophiles identifiée dans l'atlas des cellules immunitaires scRNASeq et la coloration IF dans le tissu hépatique a diminué au fil du temps NMP, tandis qu'un nombre absolu élevé de neutrophiles a été trouvé dans le perfusat. Ces découvertes correspondantes indiquent une migration rapide des neutrophiles dans le perfusat. Cela est également vrai, bien que dans une moindre mesure, pour d'autres cellules inflammatoires. Ces changements cellulaires correspondent aux modèles de cellules immunitaires obtenus dans les biopsies hépatiques en ce qui concerne leurs modèles quantitatifs et leur dynamique de base. En résumé, une migration rapide et significative principalement des neutrophiles dans le perfusat a été trouvée.

Nous avons en outre caractérisé les sous-types des principales populations de cellules immunitaires et leurs changements dynamiques dans cinq échantillons de perfusat en série à l'aide de la cytométrie en flux. À 1 h de NMP, les sous-ensembles de cellules T CD45 + CD3 + dans le perfusat comprenaient 48% [42, 54] de cellules auxiliaires T CD3 + CD4 +, tandis que 44% [37, 50] étaient des cellules T cytotoxiques CD3 + CD8 +. La proportion des deux sous-ensembles a changé de manière significative en faveur des cellules auxiliaires T CD4 + au cours du temps de perfusion. Les cellules CD3 + CD56 + NKT et les cellules T CD3 + T (TCR) Vα2.2 + CD161 + invariantes associées à la muqueuse (MAIT) ne représentaient que de petites proportions des cellules T totales sans dynamique pertinente sur le temps de perfusion (Fig. 7G). Les proportions de cellules T mémoire CD3 + CD4 + ont changé de manière significative au cours du temps de perfusion (Fig. 8A), tandis que les cellules T mémoire CD3 + CD8 + sont restées stables (Fig. 8B). Les Tregs CD4+CD25+FoxP3+ représentaient 2,32 % [1,58, 3,28] de la population de lymphocytes T à 1 h. Notamment, leur proportion augmentait significativement au cours du temps de perfusion à 4,71 % [3,29, 6,59] à 24 h de NMP (Fig. 8C). Les cellules CD45+CD56+ NK étaient majoritairement CD56dimCD16+ (94,21 % [96,11, 91,58] sans changement significatif dans le temps (Fig. 8D). Parmi les monocytes/macrophages CD14+CD16+, les cellules CD14+CD64+CD163+ Kupffer ne représentaient que de faibles proportions dans le perfusat à 1 h (5,56 % [3,39, 8,7 8]), mais une forte augmentation proportionnelle avec une perfusion prolongée a été observée (24 h NMP : 11,86 % [7,05, 19,52], Fig. 8E). Parmi les sous-types numériquement importants (c. - les éosinophiles (0,38 % [0,20, 0,59]) et les basophiles CD16+CD123+ (0,23 % [0,13, 0,34]) à 1 h NMP. Leurs proportions sont restées inchangées dans le temps (Fig. 8F). pendant le NMP (Fig. 8G, Tableau supplémentaire 3).

Les perfusats collectés à différents moments au cours de la NMP (n = 26 foies soumis à la NMP) ont été évalués pour leurs changements dynamiques des proportions de cellules T A CD4 +, de cellules T CD8 + B, de sous-types C de cellules T CD3 + avec des propriétés régulatrices, de cellules D CD56 + NK, de monocytes / macrophages E CD45 + CD14 +, de granulocytes F CD45 + HLA-DRlow et de cellules dendritiques G. Les graphiques montrent les effets marginaux. Les valeurs sont estimées à l'aide d'une analyse de régression linéaire. Les valeurs de p font référence au changement dans le temps. Les moyennes des moindres carrés calculées à l'aide d'un modèle linéaire sont présentées avec l'IC à 95 %. N = 26 échantillons biologiquement indépendants. H Niveaux d'expression génique des facteurs pro-inflammatoires indiqués (interleukines/chimiokines) dans les monocytes/macrophages et les neutrophiles avant (T0) et à la fin de la NMP (T1), évalués par scRNASeq dans huit foies de donneurs. I Spectre des interleukines/chimiokines pro-inflammatoires évaluées produites par les monocytes/macrophages et les neutrophiles et élevées au niveau des protéines dans les échantillons de perfusat collectés pendant la durée de perfusion de 26 foies de donneurs. (J) Niveaux d'expression génique de l'IL-6 et du TNF dans les monocytes/macrophages et les neutrophiles pré (T0) et à la fin de la NMP (T1) évalués par scRNASeq dans les foies transplantés (n = 6) et rejetés (n = 2). La ligne centrale indique la médiane. Les cases représentent l'intervalle interquartile (IQR) des données, les moustaches s'étendent jusqu'aux points de données les plus extrêmes à moins de 1,5 fois l'IQR. De plus, le perfusat de 26 foies de donneurs soumis à la NMP a été mesuré pour les niveaux d'IL-6 et de TNF à 1, 4, 6, 12 et 24 h de NMP et les différences entre les foies transplantés (n = 18) et rejetés (n = 8) ont été calculées. Les graphiques montrent les effets marginaux. Les valeurs sont estimées à l'aide d'une analyse de régression linéaire. Les valeurs de p font référence au changement dans le temps. Les moyennes des moindres carrés calculées à l'aide d'un modèle linéaire sont présentées avec l'IC à 95 %. N = 26 échantillons biologiquement indépendants. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Tcm : lymphocytes T à mémoire centrale, Tem : lymphocytes T à mémoire effectrice, Temra : cellules à mémoire effectrice réexprimant les lymphocytes T CD45RA, Cellules DN T : lymphocytes T double négatifs (CD4- et CD8-), Cellules NK Cellules tueuses naturelles, DCs Cellules dendritiques.

Ces données mettent en évidence la mobilisation d'un large spectre de leucocytes dans le perfusat circulant au cours de la NMP. L'analyse d'échantillons en série prélevés au cours de la période NMP de 24 h a révélé une dynamique de migration distincte. Alors que la migration d'un certain nombre de sous-types de cellules immunitaires dans le perfusat est apparue très rapidement, la mobilisation et la libération des cellules Tregs et Kupffer ont augmenté dès 12 h après la NMP.

Nous avons ensuite étudié les niveaux d'expression des gènes d'interleukine/chimiokine dans les cellules immunitaires et les niveaux de protéines dans des échantillons de perfusats en série. Alors que les monocytes/macrophages exprimaient de plus en plus les pro-inflammatoires IL1B, IL18, CXCL8, CCL2, CCL3, CCL4 et TNF, les neutrophiles exprimaient principalement CXCL8 et, dans une moindre mesure, IL1B et CXCL1 (Fig. 8H). L'expression de marqueurs anti-inflammatoires tels que l'IL10 a été induite dans les monocytes/macrophages (Fig. 8H)72.

Conformément à l'ensemble de données transcriptomiques, les cytokines pro-inflammatoires exprimées dans les monocytes/macrophages et les neutrophiles ont également augmenté dans le perfusat au fil du temps, indiquant une augmentation de la transcription et de la libération de protéines dans le microenvironnement hépatique et le perfusat (Fig. 8I). La figure supplémentaire 8 décrit la dynamique de toutes les cytokines/chimiokines au niveau des protéines au cours du temps de perfusion (les valeurs respectives sont données dans le tableau supplémentaire 4). Seules de légères altérations ont été trouvées dans les signatures transcriptomiques des cellules T et NK (Fig. 9 supplémentaire).

L'impact du type de donneur (don après mort cérébrale (DBD) vs DCD) et de l'aptitude à la transplantation (foies transplantés vs rejetés) sur la dynamique des cytokines protéiques a été évalué plus en détail. La plupart des cytokines perfusées ont augmenté avec un temps de perfusion prolongé dans tous les groupes. Les concentrations d'IL-6 étaient plus significativement élevées dans le perfusat des greffes DCD par rapport aux greffes DBD (p = 0, 05, Fig. 10 supplémentaire, tableau supplémentaire 5). Ce phénomène a également été observé lors de la comparaison des foies rejetés par rapport aux foies transplantés (p = 0,032, Fig. 8J, Fig. 10 supplémentaire, Tableau supplémentaire 6). De manière concordante, nous avons trouvé une expression élevée d'IL6 dans les monocytes/macrophages au niveau de la transcription, ce qui indique que ce type de cellule contribue au moins substantiellement à la production d'IL-6 (Fig. 8J). Outre l'IL-6, le facteur de nécrose tumorale (TNF) a également augmenté de manière significative dans le perfusat lors de la comparaison des foies rejetés et transplantés (p = 0, 012, Fig. 8J, Fig. 11 supplémentaire, Tableau supplémentaire 6).

Pris ensemble, nos données suggèrent que la réponse immunologique pendant la NMP du foie varie entre les types de donneurs et les greffes de « faible qualité » (ne convenant pas à la transplantation) par rapport aux greffes « acceptables ».

La NMP ex vivo d'organes humains est un outil clinique en évolution rapide pour améliorer et prolonger la conservation des organes. De plus, la capacité d'évaluer la fonction avant la transplantation répond à un besoin non satisfait et offre une possibilité unique d'élucider les événements moléculaires au cours de la reperfusion. Cette technologie pourrait également ouvrir la voie à un futur traitement ciblé des organes ex vivo. Comme le foie contient une énorme quantité de cellules immunitaires avec des fonctions immunorégulatrices importantes et avec une importance centrale pour une fonction hépatique adéquate73, nous avons caractérisé en profondeur les (sous)populations de cellules immunitaires dans les foies de donneurs humains et perfusés pendant la NMP et évalué les cytokines perfusées. La cartographie profonde des cellules immunitaires a indiqué une prédominance de neutrophiles dans le foie du donneur, qui sont rapidement mobilisés dans le perfusat pendant la NMP. Les neutrophiles transitent d'un état pro-inflammatoire activé vers un phénotype âgé/activé chronique/épuisé et les monocytes/macrophages expriment des caractéristiques anti-inflammatoires/tolérogéniques essentielles à la réparation tissulaire.

La NMP dans 34 foies de donneurs humains inclus dans cette étude s'est déroulée sans incident et a permis une évaluation répétée des échantillons de tissus et de perfusat sans impact sur l'intégrité des organes. Les neutrophiles ont été identifiés comme la transcriptomique sc basée sur la population de cellules immunitaires la plus répandue réalisée sur huit foies de donneurs. L'analyse multiplex IF et IHC a corroboré que les neutrophiles CD15 + sont le type de cellule immunitaire hépatique dominant, répartis sur l'ensemble de l'organe selon un schéma tacheté. Curieusement, à notre connaissance, la lignée des neutrophiles est entièrement rejetée dans les ensembles de données scRNASeq de foies humains publiés jusqu'à présent17,18,19,22,23,24,74. Cet écart est vraisemblablement attribué à des écueils méthodologiques plutôt qu'à un phénomène biologique. Parce que les neutrophiles sont un type de cellule remarquablement de courte durée75 et extrêmement fragile qui est particulièrement sensible à la dissociation et au tri des tissus, un flux de travail rapide mais doux de la dissociation des tissus à la lyse cellulaire est essentiel pour préserver ces cellules. De plus, les neutrophiles expriment une quantité exceptionnellement faible de molécules d'ARNm76, ce qui empêche leur récupération dans les données scRNASeq. Nous avons récemment démontré que les neutrophiles ne peuvent pas être correctement détectés dans les ensembles de données générés avec la plate-forme de séquençage 10x Chromium à base de gouttelettes et seulement dans une mesure très limitée avec d'autres plates-formes. Cependant, la plate-forme scRNASeq à base de micropuits appliquée dans cette étude permet de capturer un nombre relativement élevé de molécules d'ARNm par cellule et améliore ainsi la récupération des cellules à faible teneur en ARNm26. Alors que le scRNASeq de huit foies a généré un énorme ensemble de données, le nombre total et le spectre des différences de qualité du foie restent une limitation. Même si nous avons inclus des foies ECD dans cette étude, les organes peuvent varier en termes de qualité de greffe et de maladies/dommages préexistants, ce qui rend impossible de saisir toute l'étendue de la variation interindividuelle dans cet effort.

Il a été démontré que les circuits inflammatoires pilotés par les neutrophiles, tels qu'observés dans nos perfusats de NMP, favorisent diverses pathologies hépatiques aiguës et chroniques77. Semblables aux neutrophiles, les monocytes/macrophages sont des régulateurs clés de l'homéostasie tissulaire et de l'activation immunitaire dans le foie78. Nous apportons ici la preuve que la NMP déclenche un passage des neutrophiles hautement activés vers un phénotype âgé/activé/épuisé de manière chronique dans le foie humain. Plus précisément, l'activation des neutrophiles par la NMP est reflétée par l'induction de l'axe IL-8/CXCR1/2, qui contribue au micromilieu pro-inflammatoire. Cela peut également conduire à la formation induite de NET entraînant une aggravation de l'IRI79 hépatique. Ces résultats suggèrent que l'inhibition de CXCR1/2 lors de l'activation des neutrophiles peut aider à limiter une réponse inflammatoire excessive au cours de la NMP.

La dynamique des monocytes/macrophages au cours de la NMP ne peut pas être décrite sans ambiguïté comme un phénotype pro- ou anti-inflammatoire, mais indique plutôt une séquence de réponse et de contre-réponse. Ceci est également reflété par l'analyse des sous-groupes démontrant que les monocytes/macrophages pro-inflammatoires sont diminués, tandis que les sous-types anti-inflammatoires et tolérogènes ("M2-like") impliqués dans la prolifération cellulaire, l'angiogenèse, la cicatrisation et la réparation des tissus sont significativement augmentés pendant la NMP, respectivement.

La compréhension actuelle de l'impact de la NMP (et de la machine à perfusion en général) sur le profil inflammatoire/répertoire de cellules immunitaires d'un organe est limitée80. Dans le foie des rats, il a été démontré que les modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP) induisent des lésions tissulaires pendant la perfusion de la machine81. Dans un modèle similaire, il a été démontré que la NMP induisait une large signature d'expression génique inflammatoire et l'activation des cellules immunitaires résidant dans le foie. Le traitement à l'IL-10 et au facteur de croissance transformant (TGF)-ß a entraîné une modération de l'inflammation dans ce modèle82. Dans une étude menée sur des foies humains, la NMP a inhibé l'inflammation et favorisé la régénération du greffon83.

Conformément à l'expression accrue de cytokines observée dans six foies sur 6 h de NMP par Lee et al., nous avons trouvé une expression de cytokines pro- et anti-inflammatoires dans le perfusat83. L'accumulation d'interleukines/chimiokines dans le perfusat correspond aux modifications transcriptomiques des neutrophiles et des monocytes/macrophages dans le parenchyme hépatique. Une augmentation significative de l'IL-6 dans le perfusat des greffons DCD et des foies rejetés peut être le signe d'une réponse inflammatoire plus prononcée dans ces organes. En effet, Ohman et al.84 ont récemment rapporté que la réponse immunitaire dans les foies de faible qualité/fonctionnant de manière inférieure différait des greffons fonctionnels lorsqu'ils étaient soumis à la NMP, bien que des niveaux élevés exorbitants de perfusat d'IL-6 aient été signalés pour les deux groupes. Ainsi, nos observations nécessitent une plus grande attention avant la détermination de leur signification clinique.

La mobilisation et la transition des leucocytes et en particulier des neutrophiles dans le perfusat ont été extrêmement rapides. Ceci est cohérent avec les données provenant des poumons et des reins porcins pendant la NMP. Dans ces études, une migration excessive était également liée à une immunogénicité réduite avec des taux de rejet aigu inférieurs13,14. Nous décrivons ici en détail les cellules immunitaires perfusées et donnons un aperçu des changements dynamiques jusqu'à 24 h de perfusion dans une cohorte de 26 foies humains. Alors qu'un nombre important de cellules était présent dans le perfusat à la fin de la NMP dans notre étude, la diminution de la plupart des types de cellules avec le temps de perfusion semble indiquer une atténuation de cet effet. Alternativement, les cellules immunitaires circulantes peuvent migrer vers le foie. Des études de suivi plus détaillées et futures des cellules immunitaires entre les tissus et le perfusat éclaireront plus en détail ce processus dynamique.

De plus, la modulation de ce processus, par exemple par la mobilisation active des leucocytes et/ou l'élimination des leucocytes, peut réduire la charge antigénique/inflammatoire du foie pendant la NMP. Cependant, un retrait aveugle peut ne pas être idéal, car des sous-ensembles de cellules immunitaires circulantes sont également impliquées dans la régénération tissulaire, le remodelage tissulaire, la guérison et l'induction de la tolérance80. A titre d'exemple, nous démontrons une forte induction d'un phénotype anti-inflammatoire "M2-like" dans les monocytes/macrophages au cours de la NMP. Cela peut favoriser les mécanismes de réparation et de remodelage des tissus et nous suggérons donc une élimination plus ciblée des sous-ensembles de cellules immunitaires inflammatoires et potentiellement dommageables pour les tissus. Ici, nous suggérons que le ciblage sélectif des neutrophiles pro-inflammatoires (par exemple par des antagonistes CXCR2) pourrait être une première étape vers une immunomodulation ciblée pendant la perfusion ex vivo. De plus, la filtration des cytokines pro-inflammatoires pendant la NMP pourrait également être bénéfique. Les premiers résultats d'un essai de perfusion rénale humaine ont indiqué un effet positif sur les signatures d'expression génique associées à la fonction de greffe retardée85.

En conclusion, notre analyse complète met en évidence la dynamique du répertoire des cellules immunitaires hépatiques au cours de la NMP des foies humains au niveau transcriptomique et protéique. Une cartographie approfondie des cellules immunitaires a révélé la prédominance des neutrophiles dans le foie des donneurs humains. Avec une variété d'autres populations de cellules immunitaires, ces cellules transmigrent rapidement dans une large mesure dans le perfusat pendant la NMP hépatique. Avec la prolongation de la perfusion, le statut d'activation des cellules immunitaires diverge d'un phénotype pro-inflammatoire à un phénotype épuisé mais aussi régénérateur. Nos résultats et les ensembles de données correspondants peuvent servir de base à de futures études interventionnelles et ouvrir de nouvelles voies pour atténuer l'inflammation par immunomodulation ciblée pendant la NMP et la LT.

Cette recherche est conforme à toutes les réglementations éthiques pertinentes. L'étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel (protocole n ° 1175/2018) de l'Université de médecine d'Innsbruck. Le consentement éclairé de tous les participants a été préalablement obtenu.

Entre avril 2019 et juillet 2021, un total de 34 foies de donneurs soumis à la NMP ont été recrutés. Tous les organes ont été acceptés dans l'intention d'être transplantés après la NMP. Les foies ont été rincés lors de la récupération à l'aide de la solution de l'Université du Wisconsin (UW, n = 14) ou de l'histidine-tryptophane-cétoglutarate (HTK, n = 20) et expédiés selon les conditions standard d'entreposage au froid en utilisant le même liquide de conservation sur glace. Après transport vers notre établissement (concept de retour à la base), les foies ont été perfusés à l'aide du dispositif OrganOx metra selon les protocoles locaux2. À leur arrivée dans notre centre, les greffons ont été rincés avec 2000 ml de HTK pour éliminer toutes les cellules sanguines restantes. Les foies ont ensuite été préparés chirurgicalement pour la NMP et connectés à la machine de perfusion. Le perfusat de NMP consistait en trois unités de concentré de globules rouges appauvris en leucocytes de type O (irradiation de 30 Gy) (RBC, 300 ml chacun), 500 ml de gelofusine (B. Braun) et des additifs selon le protocole du fabricant. Selon les normes locales, une unité emballée de poche de globules rouges appauvrie en leucocytes contient au maximum 1 × 106 leucocytes. Un protocole standardisé pour la PNM incluant un schéma d'analyses de perfusat tel que récemment établi dans notre établissement a été appliqué2. Cela comprend une approche multidisciplinaire avec observation et gestion des organes à l'USI. La décision de transplanter ou de jeter un organe était basée sur la diminution du lactate, le maintien du pH et la consommation de glucose. Le maintien des valeurs de pH physiologique (7,3 à 7,45) sans supplémentation en bicarbonate de sodium après 2 h de NMP ainsi qu'une diminution rapide et le maintien du lactate à des niveaux physiologiques (≤ 18 mg/dl) sont considérés comme des facteurs clés indiquant un bon fonctionnement des organes. De plus, des niveaux exceptionnellement élevés d'AST, d'ALT et de lactate déshydrogénase (> 10 000 U/l) et une forte inclinaison de ces paramètres sont considérés comme des signaux d'avertissement. Les receveurs de foie inclus dans l'étude étaient des adultes âgés de ≥ 18 ans, inscrits pour une première ou une retransplantation.

Sur 34 foies de donneurs soumis à la NMP, une analyse scRNASeq a été réalisée dans huit foies d'étude sélectionnés au hasard. Par conséquent, des échantillons de biopsie hépatique en coin ont été prélevés à trois moments individuels, c'est-à-dire avant la NMP (T0), à la fin de la NMP (T1) et après la reperfusion (T2) en cas de transplantation. Des échantillons de perfusion en série de 26 autres foies d'étude ont été prélevés à 1, 4, 6, 12 h et à la fin du NMP pour la quantification/phénotypage cellulaire et l'évaluation des cytokines par cytométrie en flux et analyse Luminex. Des informations détaillées sur le nombre d'échantillons, la collecte de tissus/perfusats, les points temporels et le type d'analyse sont fournies à la Fig. 1.

Les biopsies hépatiques prélevées avant (T0) et à la fin (T1) de la NMP ainsi qu'après la reperfusion (T2) (n = 8 foies) ont été immédiatement hachées en petits morceaux (<1 mm) sur de la glace et ensuite digérées par voie enzymatique pendant 10 min à 37 ° C avec agitation à l'aide du réactif de dissociation BD TuDoR (BD Biosciences). La suspension unicellulaire a été filtrée à travers un tamis cellulaire de 100 µM et les globules rouges ont été éliminés avec la solution de lyse BD Pharm Lyse (BD Biosciences) selon le protocole du fabricant. La viabilité cellulaire a été mesurée avec la plateforme BD Rhapsody scRNASeq (BD Biosciences) en utilisant Calcein-AM (Thermo Fisher Scientific) et Draq7 (BD Biosciences).

La suspension unicellulaire fraîchement isolée a été immédiatement traitée (<30 min de la dissociation tissulaire à la lyse cellulaire) et des bibliothèques de séquençage d'amplification du transcriptome entier (WTA) ont été générées selon le protocole WTA unicellulaire de BD Rhapsody. Nous avons sélectionné la plateforme BD Rhapsody scRNASeq basée sur des micropuits dans le but de déconvoluer complètement la dynamique des leucocytes, car elle permet de représenter des cellules à faible teneur en ARNm (par exemple, les neutrophiles) et peut entraîner la perte de grandes cellules > 40 µm (hépatocytes) en raison d'un phénomène d'exclusion des billes. La qualité des bibliothèques de séquençage obtenues a été vérifiée avec le système 4200 TapeStation (Agilent) et le kit de test Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) (Thermo Fisher Scientific). Le séquençage a été effectué sur la plate-forme NovaSeq 6000 System (Illumina) avec le kit de réactifs S1 v1.5 (200 cycles, 68 bp index read 1 ; Illumina) à une profondeur de séquençage calculée de 50 000 lectures/cellule.

Le prétraitement bioinformatique des fichiers de séquençage FastQ obtenus a été effectué via l'environnement basé sur le cloud Seven Bridges Platform (Seven Bridges Genomics) à l'aide de l'application BD Rhapsody WTA Analysis Pipeline. Les données ont été chargées dans AnnData86 pour un traitement ultérieur avec des outils scverse. Le contrôle qualité a été effectué à l'aide de scanpy87, en ne conservant que les cellules avec (1) entre 250 et 8 000 gènes détectés, (2) entre 1 000 et 100 000 transcrits et (3) < 30 % de transcrits mitochondriaux. Les 4000 gènes les plus variables (HVG) ont été sélectionnés à l'aide de la fonction high_variable_genes de scanpy avec les options flavor = "seurat_v3" et batch_key = "patient". Les transcriptomes cellulaires ont été intégrés dans un espace latent de faible dimension corrigé par lot à l'aide de scVI88,89, en traitant chaque échantillon comme un lot séparé. Les doublets ont été identifiés et supprimés à l'aide de SOLO90 tel qu'implémenté dans scvi-tools89. Un graphe de voisinage et une approximation et une projection de variété uniforme (UMAP) 91 ont été calculés sur la base de l'espace latent du scVI. Les types de cellules ont été annotés sur la base d'un regroupement non supervisé avec l'algorithme de Leiden92 et des gènes marqueurs connus.

Nous avons utilisé DESeq293 sur des échantillons pseudo-globaux pour les tests d'expression différentielle, dont il a été démontré qu'ils fonctionnaient bien et corrigeaient correctement les fausses découvertes94. Pour chaque type de cellule et chaque patient, nous avons résumé le nombre de transcrits pour chaque gène exprimé dans au moins 5 % des cellules à l'aide du découpleur-py95. Les échantillons pseudo-en vrac constitués de moins de 1000 comptages ou 10 cellules ont été jetés. Les valeurs de p ont été ajustées pour les tests d'hypothèses multiples avec pondération d'hypothèse indépendante (IHW)96. Les gènes marqueurs pour les sous-groupes de monocytes/macrophages et de neutrophiles ont été déterminés à l'aide de l'aire sous la courbe des caractéristiques de l'opérateur récepteur (AUROC) et des métriques de changement de pli log2 sur des échantillons pseudo-globaux tels que définis dans Becht et al.91. Les gènes marqueurs ont été définis comme ayant un AUROC > 0,7 et un changement de facteur log2 > 1 pour les neutrophiles et > 2 pour les monocytes/macrophages.

Nous avons effectué une analyse des facteurs de transcription avec DoROthEA97 en utilisant un modèle linéaire multivarié tel qu'implémenté dans le découpleur-py95. Seuls les régulons avec les niveaux de confiance les plus élevés "A" et "B" ont été utilisés. Les changements de pli de l'analyse DESeq2 ont été utilisés comme données d'entrée. De plus, nous avons effectué une analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes à l'aide d'un test de surreprésentation (ORA, c'est-à-dire le test exact de Fisher) tel qu'implémenté dans le découpleur-py. Les comparaisons DE entre différents types de cellules ont une puissance statistique différente en raison d'un nombre différent d'échantillons pseudo-globaux. Pour éviter les biais dus aux différents nombres de gènes exprimés de manière différentielle par type de cellule, nous avons utilisé les 182 gènes les plus exprimés de manière différentielle pour chaque type de cellule pour le test de surreprésentation, ce qui correspond au nombre médian de gènes DE dans tous les types de cellules à un taux de fausse découverte (FDR) < 0,01 et |log2 fold change | > 1.

Nous avons utilisé la base de données CellChat29 obtenue à partir d'omnipathdb29 pour étudier les différences de communication de cellule à cellule entre les points temporels. L'algorithme CellChatDB original est conçu pour trouver les différences entre les types de cellules. Pour notre étude, en revanche, nous nous sommes intéressés aux différences entre les points temporels, en utilisant des patients comme répliques biologiques. Par conséquent, pour chaque type de cellule d'intérêt, nous avons examiné la liste des ligands exprimés de manière significativement différentielle dans CellChatDB. Pour chacune de ces molécules de signalisation différentiellement exprimées et pour chaque type de cellule, nous avons déterminé les partenaires d'interaction qui sont potentiellement affectés par ce changement, comme ceux qui sont exprimés dans au moins 10 % des cellules d'un certain type de cellule. Les molécules de signalisation différentiellement exprimées ont été déterminées avec DESeq2 comme décrit ci-dessus. La fraction de cellules exprimant une molécule de signalisation a été calculée comme la moyenne des fractions par patient, pour éviter les biais dus aux différents nombres de cellules par patient.

Des biopsies hépatiques prélevées avant (T0) et à la fin (T1) du NMP (n = 10 sélectionnés au hasard sur 26 foies) ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % et incluses dans de la paraffine. La coloration IF multiplexée a été réalisée sur des coupes de 4 µm à l'aide du kit d'immunohistochimie automatisée Opal 7-Color (cat : NEL821001KT, Akoya Biosciences). Un panel de marqueurs immunitaires a été configuré comprenant des anticorps contre CD15, CD8, CD68, CD3, CD20, cytokératine (Panel 1) et CD15, CXCR2 (Panel 2). Les marqueurs ont été appliqués séquentiellement et appariés avec les fluorophores Opal respectifs (les anticorps utilisés sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 7). La coloration a été réalisée à l'aide d'un système automatisé (BOND-RX ; Leica Biosystems). Pour visualiser les noyaux cellulaires, le tissu a été coloré avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (spectral DAPI, Akoya Biosciences). Les lames ont été numérisées à l'aide de la station de travail de pathologie quantitative Mantra 2 (Akoya Biosciences) et du logiciel Mantra Snap v1.0.4. Cinq à huit images représentatives de chaque tissu ont été acquises pour l'analyse. Le démixage spectral, l'analyse d'images multispectrales et le phénotypage cellulaire ont été effectués à l'aide du logiciel d'analyse de tissus inForm v2.4.10 (Akoya Biosciences). La densité des cellules immunitaires a été quantifiée et est exprimée en "nombre de cellules/mm2". Le test t apparié a été utilisé pour évaluer les différences entre les deux groupes. Dans l'analyse groupée, les points de données sont présentés sur des diagrammes de dispersion avec des moyennes ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les analyses ont été réalisées avec GraphPad Prism v6.0.

Les cellules isolées des biopsies hépatiques pré-NMP (T0) et à la fin de la NMP (T1) ont été colorées avec un cocktail de 19 anticorps (tableau supplémentaire 8) à des concentrations pré-titrées et, après lavage et ajout de 7-AAD, mesurées sur un cytomètre en flux FACSymphony A5. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo v10.7 (pour plus de détails sur la stratégie de déclenchement, voir la Fig. 12 supplémentaire).

Des échantillons de perfusat en série de 26 foies soumis à la NMP (5 ml) ont été collectés dans des tubes Cyto-Check BCT (Streck) à 1, 4, 6, 12 h et à la fin de la NMP. La fixation immédiate des cellules dans ces tubes maintient la morphologie cellulaire et l'expression de l'antigène de surface et permet le stockage des échantillons à température ambiante pendant au moins 5 jours. Dans notre étude, les tubes de fixation ont été choisis pour faciliter la logistique. 500 µl de perfusat ont été utilisés pour chaque coloration. Initialement, les globules rouges de 500 µl de perfusat ont été lysés avec le tampon de lyse RBC (Thermo Scientific, eBioscience). Après blocage avec Fc Blocking Reagents (BD Bioscience), les cellules ont été incubées avec les mélanges maîtres d'anticorps dans diverses combinaisons contenant les anticorps mentionnés dans le tableau supplémentaire 9. Pour la coloration intracellulaire FoxP3, les cellules ont été perméabilisées à l'aide du Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Thermo Scientific, ebioscience) et incubées avec du sérum de rat normal (Thermo Scientific, ebioscience) avant l'incubation avec l'anticorps FoxP3. Pour la quantification du nombre absolu de cellules, des tubes BD Trucount (BD Bioscience) ont été utilisés conformément au protocole du fabricant et analysés à l'aide d'un cytomètre en flux LSRFortessa (Becton Dickinson and Company). L'exclusion des doublets a été obtenue en traçant les zones de diffusion vers l'avant et latéralement, les hauteurs et les largeurs (FSC- et SSC-A/-H/-W). Les données ont été analysées avec FlowJo v6.2 (Tree Star). La stratégie de déclenchement est présentée dans les Figs supplémentaires. 13–20. Pour les tests de viabilité cellulaire, le perfusat a été collecté au début du NMP, après 1 h et à la fin du NMP (n = 5). Les globules rouges ont été lysés avec un tampon de lyse RBC et les leucocytes ont été colorés avec du bleu trypan. Un minimum de 150 cellules/échantillon a été compté en double, les résultats ont été moyennés et le pourcentage de cellules mortes/vivantes a été calculé.

Des échantillons de perfusat en série de 26 foies soumis à la NMP ont été centrifugés et 500 µl de sérum ont été congelés à -80 °C. Les niveaux de protéines de cytokines/chimiokines ont été mesurés à l'aide du Cytokine&Chemokine 34‐Plex Human ProcartaPlex Panel 1A (EPX340-12167-901, Thermo Fisher Scientific) dans un instrument Luminex MAGPIX (Luminex Corporation) et analysés par le logiciel xPonent 4.2 Rev.2 (Luminex Corporation) selon le protocole du fabricant. Le profilage des cytokines a été lu à la lumière du type de donneur (foies DBD vs DCD) et du statut de transplantation (foies transplantés vs rejetés).

Les données de perfusion sont exprimées en valeurs absolues ou proportions (%), moyennes estimées ± écart type (SD) et intervalle de confiance (IC) à 95 %. Un modèle linéaire à effets mixtes pour mesures répétées (LMM) a été utilisé pour la dynamique de la composition cellulaire. Compte tenu de la distribution asymétrique positive, une transformation logarithmique a été effectuée. Une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour évaluer les différences en tenant compte de la perfusion globale au cours du temps. L'analyse de l'expression différentielle des gènes à cellule unique a été réalisée à l'aide de DESeq2 sur des échantillons pseudo-en vrac agrégés par réplique biologique. Les analyses ont été effectuées à l'aide du logiciel statistique R (v4.0.3, Team RC, R Foundation for Statistical Computing)98. Les graphiques ont été complétés à l'aide de GraphPad Prism 9.1.0 (216). Les valeurs P pour les analyses non ciblées (gènes DE, TF, ensembles de gènes) ont été ajustées par FDR. Les niveaux de signification et plus de détails sur les tests statistiques sont indiqués dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données de séquence qui appuient les résultats de cette étude (toutes les figures) sont disponibles via l'accession NCBI GEO GSE216584. Toutes les autres données sont disponibles dans l'article et ses fichiers supplémentaires ou auprès de l'auteur correspondant sur demande. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code source pour reproduire l'analyse des données est disponible sur https://github.com/icbi-lab/nmp-liver. Les données d'entrée traitées et les dépendances logicielles conteneurisées requises pour exécuter le code sont disponibles sur zenodo : https://doi.org/10.5281/zenodo.7249006.

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Les auteurs tiennent à remercier Astrid Drasche et Annabella Pittl pour le soutien technique et DI Wolfgang Peter pour le soutien statistique. La recherche a été soutenue par le Fonds scientifique autrichien FWF (Grant No. TAI-697) (DW), le "In Memoriam Gabriel Salzner Stiftung" (SS, DW), Tiroler Wissenschaftsfond (TH), Jubiläumsfonds— Österreichische Nationalbank (RO), FFG grant Austrian Research Promotion Agency, 858057 (HD FACS, S.So.). GS a été soutenu par une bourse DOC de l'Académie autrichienne des sciences. L'auteur Margot Fodor (MF) utilisera une partie des matériaux et des données de cette étude pour l'achèvement de son doctorat. thèse.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : T. Hautz, S. Salcher, M. Fodor.

Ces auteurs ont dirigé conjointement ce travail : D. Wolf, S. Schneeberger.

Département de chirurgie viscérale, de transplantation et thoracique, Centre de médecine opératoire, Laboratoire organLife et Laboratoire de recherche D. Swarovski, Université médicale d'Innsbruck, Innsbruck, Autriche

T. Hautz, M. Fodor, S. Ebner, B. Cardini, J. Hofmann, T. Resch, F. Krendl, A. Weissenbacher, G. Otarashvili, D. Öfner, J. Troppmair, R. Oberhuber & S. Schneeberger

Département de médecine interne V, hématologie et oncologie, Comprehensive Cancer Center Innsbruck (CCCI), Medical University of Innsbruck, Innsbruck, Autriche

Salcher S, Mair A, Trebo M, Untergasser G, Sopper S, Martowicz A, Daum S, Kalb M, Pircher A et Wolf D

Institut de bioinformatique, Biocentre, Université de médecine d'Innsbruck, Innsbruck, Autriche

G. Sturm & Z. Trajanoski

Tyrolpath Obrist Brunhuber GmbH, Zams, Autriche

G. Untergasser, A. Martowicz & P. ​​​​Obrist

Institut de pathologie, de neuropathologie et de pathologie moléculaire, Université de médecine d'Innsbruck, Innsbruck, Autriche

B.Zelger

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Conceptualisation et conception de l'étude (TH, RO, AP, DW, S.Sc.), collecte de données (MF, BC, JH, TR, FK, AW, GO, RO, AP), séquençage de l'ARN sc et analyse des données (S.Sa., GS, GU, A.Mai., MT, S.So., MK), analyse par cytométrie en flux et analyse des données (SE, MF, TH, S.So.), analyse Luminex et analyse des données (MF, TH), pathologie et micro analyses scopiques (A.Mar., PO, BZ), visualisation (S.Sa., MF, GU, A.Mar., SD, D.Ö., ZT, JT), rédaction du brouillon original (TH, S.Sa., MF), révision et édition finale de l'article (tous). OR, PA, WD et SS ont contribué à parts égales en tant qu'auteurs principaux.

Correspondance à D. Wolf ou S. Schneeberger.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Damien Chaussabel et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Hautz, T., Salcher, S., Fodor, M. et al. Dynamique des cellules immunitaires déconvoluée par le séquençage d'ARN unicellulaire dans la machine de perfusion normothermique du foie. Nat Commun 14, 2285 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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Reçu : 22 février 2022

Accepté : 27 mars 2023

Publié: 21 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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